吴亚男1,2 钟锋2 周凯意1 刘柏杨3 雷黎明1 王晟1,4

1华南理工大学医学院，广州 510006；2南方医科大学附属广东省人民医院（广东省医学科学院）麻醉科，广州 510080；3广东医科大学附属医院肿瘤科，湛江 524000；4首都医科大学附属安贞医院麻醉中心，北京 100029

国际麻醉学与复苏杂志,2023,44(03):232-237.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20221115‑00748

 基金项目 

国家自然科学基金地区科学基金项目（82160157）

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究旨在探讨心力衰竭（HF）后出现认知功能障碍的内在机制以及雷帕霉素靶分子（mTOR）信号通路在其中的作用。

1 材料与方法    

1.1　实验动物分组及处理

实验选用健康C57BL/6（8~12周龄）雄性小鼠，动物被饲养在湿度控制为60%±10%的房间里，温度为（24±1） °C，保持12 h的光暗循环。将22只小鼠按随机数字表法分为两组：① 假手术组（Sham组，10只）；② 慢性心力衰竭组（HF组，12只）。HF组小鼠采用水合氯醛溶液麻醉，麻醉后在颈中部暴露气管，插入气管导管后连接动物呼吸机（潮气量设置为200~300 μl，呼吸频率100 次/min）。在剑突上约1 cm处横向剪开一个切口，钝性分离肌肉，在4~5肋间隙下进入胸腔，暴露心脏，然后撕开心包膜，在左心耳中部下缘2 mm处结扎左冠状动脉前降支，结扎后可见心尖变白，后逐层缝合肌肉与皮肤，待小鼠苏醒后拔管。Sham组仅撕开心包膜不结扎冠状动脉左前降支。

造模后1个月，用小动物超声机对两组小鼠进行超声心动图检查，记录其左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室舒张末期容积、左室收缩末期容积、左室射血分数和缩短分数。待完成水迷宫实验后通过过量麻醉处死实验动物，并取两组小鼠心脏组织用Masson三色染色试剂盒进行马松染色，染色方法参照说明书。

1.2　Morris水迷宫实验检测小鼠认知功能

采用Morris水迷宫（型号：ZH，淮北正华生物科技有限公司）实验检测小鼠空间学习记忆能力。将小鼠从动物房移至行为学房间，适应1 h。接通水迷宫电源，将水温调控在21 ℃~22 ℃。在训练过程中，逃生平台置于水下1 cm。让小鼠在水中探索，直至小鼠学会寻找逃生平台并爬上去，一旦小鼠到达逃生平台，停止计时器，并记录时间，限时60 s；如果它在60 s内没有找到平台，则将此实验的时间记录为60 s，并用手将小鼠引导到平台上，让小鼠在平台上停留20 s；一旦完成实验，用毛巾将小鼠擦干放回笼子。每天分别从不同的象限将小鼠放入水中，同一只小鼠每次训练需间隔时间5 min以上，连续4 d，确保每只小鼠训练16次，记录每只小鼠找到逃生平台的时间。第5天行探查实验，将逃生平台从水中移除，照明和水温与训练过程相同。从某一固定象限放入小鼠，比较两组小鼠逃避潜伏期、穿越平台次数和目标象限停留时间。

1.3　免疫组织化学法检测海马组织胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、离子化钙结合接头分子1（Iba1）、少突胶质细胞转录因子2（Olig2）水平

每组小鼠经麻醉、心脏灌注后取脑。将大脑取出后在4 ℃的4％多聚甲醛中固定过夜，后在20%蔗糖溶液中沉糖，经聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物包埋后存放在−80 ℃冰箱。选取适当的脑片先用PBS溶液漂洗3次，每次5 min，随后加入3%H2O2溶液，去除内源性H2O2，该过程持续15 min。洗涤后使用10%牛血清白蛋白与0.02%TritonX‑100混合溶液室温封闭2 h，后加入一抗孵育过夜。在本研究中，GFAP（1∶1 000稀释）、Iba1（1∶2 000稀释）、Olig2（1∶500稀释）用作一抗。随后脑片用PBS溶液漂洗3次，在二抗溶液中孵育1 h再次洗涤。最后加入DAB显色液，显色满意则将切片贴于明胶包被的载玻片上，晾干后封片。使用显微镜对细胞视野进行成像。通过Image‑Pro Plus 6.0测量出每张图片的累积光密度值，每张图片取平均光密度值，此值反映目标蛋白表达的强弱。

1.4　Western blot检测海马组织蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p‑Akt）、mTOR、磷酸化雷帕霉素靶分子（p‑mTOR）水平

从小鼠海马组织中提取蛋白并用超微量紫外分光光度计测量蛋白浓度，将样品与5×样品缓冲液混合，并在100 ℃下加热10 min。使用SDS‑PAGE在10%凝胶上从每个样品中分离等量的蛋白质，然后电泳转移至PVDF膜；用牛血清白蛋白溶液封闭2 h，并在4 ℃下与一抗Akt（1∶1 000稀释）、p‑Akt（1∶1 000稀释）、mTOR（1∶1 000稀释）、p‑mTOR（1∶1 000稀释）结合过夜；后与二抗孵育2 h，其间用Tris‑HCl缓冲盐溶液漂洗；最后使用成像系统将条带可视化，并用通过Image J软件分析条带。以p‑Akt/Akt、p‑mTOR/mTOR表示Akt、mTOR磷酸化水平。

2 结 果   

2.1　两组小鼠心脏超声心动图结果比较

与Sham组比较：HF组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室舒张末期容积、左室收缩末期容积明显增加（P<0.05），左室射血分数、左室缩短分数明显降低（P<0.05）。见表1。结扎左冠状动脉前降支后HF组小鼠心肌出现明显纤维化，而Sham组心肌呈现正常状态。见图1。

2.2　两组小鼠水迷宫实验结果比较

HF组小鼠逃避潜伏期长于Sham组（P<0.05），且穿越平台次数、目标象限停留时间少于Sham组（P<0.05）。见表2。

2.3　两组小鼠海马组织GFAP、Iba1、Olig2水平比较

HF组海马组织GFAP、Iba1、Olig2水平高于Sham组（t=7.09，P<0.001；t=5.13，P<0.001；t=3.92，P=0.004）。见图2。

2.4　两组小鼠海马组织p‑Akt/Akt、p‑mTOR/mTOR水平比较

HF组海马组织中p‑AKT/AKT、p‑mTOR/mTOR水平高于Sham组（P<0.05）。见图3。

3 讨 论    

了解认知功能障碍与HF共病的机制将有助于识别新的、有效的治疗方法，改善HF患者的长期预后。本研究在建立HF小鼠模型1个月后行水迷宫实验发现，HF组小鼠的逃避潜伏期长于Sham组，而穿越平台次数和目标象限停留时间低于Sham组，提示HF小鼠会出现认知功能障碍。HF中认知功能障碍的发病机制是多因素的，其中最常见原因是心脏收缩功能障碍，导致脑灌注减少。除此之外，神经激素激活、氧化应激、慢性炎症、神经胶质细胞激活、脑程序性细胞死亡和线粒体功能障碍都被认为是HF并发认知功能障碍的可能原因。然而，仍然需要进一步研究以确定心脏和大脑之间的神经激素连接，为新的治疗策略的发展提供思路。

在本研究中，建立HF模型后1个月，通过水迷宫实验证明了HF组小鼠的认知功能受到了损伤。本研究进一步发现，HF组海马组织中小胶质细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞呈现出活化状态。因此，基于神经胶质细胞活化状态引起的认知功能障碍这一机制，通过特定的药物抑制神经胶质细胞的活化，或特异性清除异常活化的神经胶质细胞，可能是认知功能障碍的潜在治疗方法。

本研究在探讨HF小鼠合并认知功能障碍的机制中发现，HF小鼠海马区出现Akt/mTOR通路的异常激活，并伴有神经胶质细胞向促炎状态的转变。这些结果提示，抑制HF小鼠海马区Akt/mTOR信号通路的活性是否可以产生抗炎作用，从而消除其神经胶质细胞的激活，改善HF患者的认知功能；同时，Akt/mTOR通路的激活通过何种更确切的机制导致神经胶质细胞活化，HF小鼠出现认知功能障碍，也需要更进一步的探索。

来源 | 健康界

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