导致PARP抑制剂（PARPi）耐药的患者特异性分子变异尚未得到充分研究。延世大学开展了一项研究，分析了从接受PARPi治疗的BRCA1/2突变患者中连续收集的循环肿瘤DNA（ctDNA）基因检测结果，探索了耐药机制及其对进展后治疗疗效和生存的影响。2018年1月至2021年12月期间前瞻性纳入患者（NCT05458973）。在PARPi治疗前以及治疗期间（每3个月一次）收集全血样本，直到进展。从样本中提取ctDNA，使用531基因panel测序，分析不同的耐药机制。

54例患者纳入分析。PARPi治疗前样本肿瘤突变负荷高以及存在复制叉稳定和药物外排相关基因突变与PARPi治疗的无进展生存期较短有关。3例患者发生BRCA回复突变，1例患者发生BRCA亚效突变。在29例有匹配样本的患者中，PARPi治疗进展后，突变种类增多，89.7%的患者至少检出一个PARPi治疗前未检出的突变。这些突变提示非互斥性获得性耐药机制——同源重组修复恢复（28%），复制叉稳定（34%），生存通路上调（41%），靶点丢失（10%）和药物外排（3%）。同源重组修复恢复患者（P=0.003）和同时存在两种或以上耐药机制的患者（P=0.040）后续化疗的无进展生存期较短。本研究对连续ctDNA检测结果进行了分析，发现了多种获得性耐药机制，为改善进展后治疗和生存提供了有价值的信息。

研究背景

PARP抑制剂（PARPi）治疗是一种靶向治疗，利用同源重组修复（HRR）能力的固有缺陷，导致合成致死。PARPi已成为卵巢癌的标准治疗选择，带来出色的生存获益，特别是在BRCA突变的患者中。最初，2018年，FDA批准了奥拉帕利，PARPi适应症现已扩大到包括具有同源重组缺陷的BRCA野生型患者，甚至乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌患者。然而，PARPi原发性或获得性耐药不可避免。临床证据表明，一旦患者PARPi治疗进展，他们对后续化疗的反应可能比从未使用过PARPi的患者差。因此，了解导致PARPi耐药的患者特异性分子变异，并确定克服方案，已成为紧迫的临床目标。

只有少数研究基于组织活检样本探索了卵巢癌PARPi耐药机制。研究最多的PARPi耐药机制包括BRCA回复突变，开放阅读框的恢复，导致BRCA重新激活。其他耐药机制主要在临床前模型中得到描述。这些机制包括HRR相关机制和非HRR相关机制，HRR相关机制包括HRR恢复和非BRCA回复突变，非HRR相关机制包括复制叉稳定，生存通路上调（即WNT信号通路，PI3K/Akt/mTOR通路和癌基因激活），靶点丢失和药物外排增加。固有的高度肿瘤内异质性，特别是高级别浆液性卵巢癌，以及获得性耐药机制可能是非互斥的并随着时间的推移而演变，使得PARPi耐药机制的研究较为复杂。

基于循环肿瘤DNA（ctDNA）的液体活检是连续肿瘤组织活检的无创替代方法，是研究耐药机制的有效方法。虽然ctDNA最初用于肿瘤识别和预后分层，但目前在临床研究中越来越多地用作监测肿瘤动力学和治疗反应以及识别靶向治疗靶点的手段。NGS的引入进一步提高了ctDNA的分析潜力。组织活检是侵入性的，复发后通常难以进行，具体取决于解剖位置。ctDNA作为非侵入性替代方法，可以克服肿瘤内异质性，在PARPi治疗期间捕获肿瘤分子信息的动态变化。

本研究分析了从接受PARPi治疗的BRCA突变卵巢癌患者中连续收集的ctDNA，探索了患者特异性耐药机制及其对进展后治疗结果和生存的影响。主要目的是识别PARPi进展的耐药机制。次要目的是识别潜在的治疗前PARPi疗效预测标志物，以及进展后后续治疗疗效预测标志物。

研究结果

患者纳入流程和人口统计学特征

2018年1月至2021年12月期间，前瞻性纳入了64例患者（图1A）。在排除不符合条件的患者和DNA提取失败的患者后，54例患者纳入分析（图1B）。胚系BRCA突变（72.2%），高级别浆液性癌（96.3%）和晚期疾病（90.7%）占多数。患者接受PARPi治疗（奥拉帕利，n = 39；尼拉帕利，n = 15），44/54例患者（81.5%）接受PARPi作为维持治疗。在数据截止时（2022年7月27日），39/54例患者（72.2%） PARPi治疗进展，从29例患者中获取了PARPi前和PARPi后ctDNA，进行匹配样本分析。PARPi治疗进展的患者和仍在接受治疗的患者的中位PARPi治疗持续时间分别为8.9个月（IQR，5.4-13.0）和26.2个月（IQR，21.7-31.1）。

PARPi前ctDNA分析：基线基因特征作为PARPi疗效预测因子

从46例患者中获取了PARPi前ctDNA，38例患者（82.6%）存在至少1个突变。比较了PARPi前ctDNA与组织NGS结果的一致性。在36例使用Illumina TruSight panel进行PARPi前组织NGS检测的患者中，32例患者（88.9%）至少检出1个ctDNA突变。在35例PARPi前组织TP53突变阳性的患者中，26例患者（74.3%）的PARPi前ctDNA检出相同突变。

PARPi前ctDNA样本的突变谱如图2A所示。PARPi前ctDNA检出耐药机制相关基因突变的患者中位PFS短于没有此类突变的患者（8.4个月 vs 13.3个月，P = 0.049；图2B）。在接受PARPi维持治疗的患者中，PARPi前ctDNA TMB高的患者中位PFS往往短于基线TMB低的患者，尽管差异无统计学意义（8.9个月 vs 29.1个月，P = 0.055；图2C）。就特定耐药机制而言，关于PFS的Cox比例HR模型显示，与复制叉稳定（HR，4.17；95% CI，1.2-14.3）和药物外排（HR，3.97；95% CI，1.14-13.8）相关的基因突变与PARPi不良结局独立相关（图2D）。

PARPi后ctDNA分析：获得性突变和耐药机制

从37例患者中获取了PARPi后ctDNA，其中29例有PARPi前后匹配样本。PARPi进展后，突变种类较增多，突变频率增高。在有匹配样本的患者中，PARPi前ctDNA TMB水平为3.68 mut/Mb，PARPi后增至4.9 mut/Mb（P = 0.025）。37例患者的PARPi后ctDNA样本的突变谱如图3A所示。PARPi后特异性突变（即仅存在于PARPi后ctDNA中而不存在于PARPi前样本中的突变）标有星号。对匹配样本的分析显示，26/29例患者（89.7%）存在至少1个PARPi后特异性突变。

基于这些PARPi后特异性ctDNA突变探索患者特异性耐药机制。在29例有治疗前后匹配样本的患者中，21例（72.4%）发现了至少1种PARPi耐药机制。3例患者发现BRCA回复突变，1例患者发现BRCA2 c.631þ2T>C剪接位点突变，导致BRCA亚效（图3B）。除BRCA回复突变外，最常见的耐药机制是生存通路上调（41.4%），复制叉稳定（34.5%）和HRR恢复（27.6%），这些机制不是互斥的（图3C）。在接受PARPi治疗≥12个月的患者中，44%的患者存在与复制叉稳定和生存通路上调相关的基因突变，22%的患者存在与HRR恢复相关的基因突变。

在16/29例（55.2%）患者中发现与ATM-CHEK2-TP53通路相关的PARPi后特异性基因突变。基于Clinical Knowledge Database（CKB）数据库探索这些突变。在51个TP53突变中，排除CKB中未描述的17个突变，25/34个（73.5%）为功能缺失突变。4/14个ATM突变为无效变异，包括无义和移码突变，其余10个为意义未明的错义突变。6/16个CHEK2突变为无效变异，其余10个为意义未明的错义突变。

除了研究ctDNA样本中的SNV外，还研究了CNV。1例患者血浆（估计：4.6拷贝）和PARPi前组织（估计：5.5拷贝）均检出PIK3CA扩增，并且PARPi后血浆中仍然存在该变异。

PARPi进展后结局分析：基于获得性突变的耐药机制的意义

在29例有匹配样本的患者中，排除失访患者（n = 3）和发生急性髓系白血病的患者（n = 1）后，25例纳入进展后结局分析。在这些患者中，24例患者接受了铂类化疗，其中9例接受了PARPi再治疗。1例患者PARPi进展后未接受治疗，2个月后死于疾病进展。研究了每种耐药机制的进展后PFS和OS。HRR恢复与进展后PFS（P=0.003）和进展后OS（P <0.0001）较差相关（图4A和B）。此外，基于耐药机制数量（无、一种、多种）对患者进行分层，发现同时存在多种耐药机制的患者进展后PFS（P = 0.04）和进展后OS（P = 0.0097）较差（图4A和B）。图4C展示了进展后化疗序贯或未序贯PARPi再治疗的PFS泳池分布图以及非互斥性耐药机制。

讨 论 

尽管先前有临床前研究揭示了多种PARPi耐药机制，但在实际临床中的临床相关性和意义尚未得到评估。通过分析从接受PARPi治疗的BRCA突变卵巢癌患者中前瞻性收集的连续ctDNA，我们探索了PARPi耐药机制。82.6%的患者PARPi前ctDNA检出至少一个突变。此外，对比PARPi前后匹配ctDNA，89.7%的患者发现至少一个获得性突变，72.4%的患者发现PARPi耐药机制。本研究结果提示，多种非互斥性耐药机制共同导致耐药，耐药机制的类型和数量可能会影响进展后治疗疗效和生存。

Lheureux等人基于34例患者的配对组织活检样本全外显子组和RNA测序结果探索了PARPi耐药机制，报告PARPi进展患者继发同源重组相关基因（BRCA1，BRCA2和RAD51B）回复突变，CCNE1扩增和ABCB1上调。本研究中，分析连续ctDNA，发现了3例BRCA回复突变和1例BRCA2亚效突变，但未发现其他HRR相关基因（如RAD51B）的回复突变。此外，本研究发现，药物外排泵相关耐药机制与预后不良有关，与Lheureux等人的研究结果一致。

在基于ctDNA的耐药机制中，卢卡帕利治疗患者中BRCA回复突变已得到较充分探索，先前有研究基于2个覆盖BRCA1、BRCA2和TP53所有外显子的ctDNA panel（Guardant360和Foundation ACT）报告了该结果。Lin等人的研究显示，在铂耐药或难治性患者中，BRCA回复突变率为14.3%，而铂敏感患者为2%（1/48例）。相比之下，在本研究中，总体患者BRCA回复突变率为5.6%，胚系BRCA突变患者为7.7%，低于先前卵巢癌或乳腺癌研究报告的约20%。既往研究显示，反复使用铂类化疗引起BRCA回复突变，本研究队列中大多数患者接受PARPi维持治疗，这可能是BRCA回复突变率较低的原因之一。TMB500 panel ctDNA检测下限为0.25%，与其他基于ctDNA的检测（如Guardant或FMI）相当，因此，我们认为，是队列特征影响了BRCA回复突变率，而不是检测灵敏度的原因。在本研究中，另一个可能影响回复突变率的因素是，我们还纳入了肿瘤负荷低的患者（基于ctDNA VAF），而先前报告高突变率的研究主要纳入了肿瘤负荷高的晚期患者。尽管如此，我们发现了BRCA1/2以外基因的获得性突变，提示接受PARPi治疗的患者经常发生BRCA回复突变以外的耐药机制。例如，发现了一个亚效剪接位点突变，该突变造成BRCA1外显子7跳跃，导致功能获得。

本研究的一个局限是TMB 500 panel的设计。该panel覆盖了531个癌症相关基因，尽管panel大且使用超深度测序，但并非专门为PARPi耐药预先设计，因此，需单独分析该panel覆盖的每个基因和PARPi耐药的相关性。我们对耐药机制的探索仅限于可能与各耐药机制相关的该panel覆盖基因突变。换句话说，其他耐药机制，如已在匹配组织样本中得到研究的BRCA甲基化和突变特征，则无法评估。关于基于ctDNA的CNV检测，由于CNV的准确检测需要一定的肿瘤分数阈值（>20%），并且基于ctDNA SNV VAF估计的肿瘤分数通常非常低，因此无法确定有意义的CNV变异。

尽管存在这些局限性，TMB 500 panel可以计算TMB。先前的一项研究表明了基于TMB 500 panel的TMB计算的准确性及其与基于TCGA数据集的真实外显子组数据的相关性。虽然免疫检查点抑制剂通常采用10 mut/Mb的阈值，但卵巢癌的TMB阈值尚未确定。本研究中，患者的中位TMB为3.68 mut/Mb，符合其他卵巢癌研究报告的2-4 mut/Mb。在卵巢癌以外的癌症的靶向治疗中，TMB的预后和预测效用已得到证实。例如，基于ctDNA的TMB评估可以预测治疗反应，与接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗的非小细胞肺癌患者的生存结局有关。尚未有研究系统评估了TMB与PARPi疗效的相关性。本研究结果显示，PARPi前ctDNA TMB低的患者PFS趋于较优，尽管不显著。这一发现支持PARPi作为维持治疗比姑息治疗有效。然而，由于在卵巢癌中，TMB阈值尚未明确，此外，本研究样本量有限，因此推荐未来的研究进一步对这方面进行探索。

ctDNA为PARPi前和进展后提供具有临床意义的信息。尽管大多数BRCA突变卵巢癌患者从PARPi治疗中获益，但一小部分患者对治疗没有反应。本研究表明，在PARPi前存在药物外排或复制叉稳定相关基因突变的患者可能对PARPi反应不佳。PARPi治疗前进行ctDNA检测能够识别此类患者，帮助其寻找其他有效的治疗选择，如PARPi加抗血管生成药物或免疫检查点抑制剂，或所有3种药物联合维持治疗。此外，本研究强调，PARPi治疗进展患者连续ctDNA检测可以获得更多信息，不仅具有预后意义，还可能有助于指导进展后治疗的选择。ATM-CHEK2-TP53通路相关基因获得性突变发生率高，提示ATR抑制剂可能在进展后治疗中发挥作用，特别对于是该通路基因获得性突变的患者。在PARPi后ctDNA样本中，其他较常见的潜在靶点包括PIK3CA和BET，有临床试验探索相关靶向药物。

本研究的局限之一是样本量较小。此外，由于TMB500 panel覆盖的531个癌症相关基因是预先设计的，我们对PARPi耐药机制的研究不可避免地受到基因选择偏倚的影响。另一个重要的局限是，由于基因组机制是在DNA水平上研究的，无法探索先前描述的或新的与基因表达或基因组特征改变相关的耐药机制。因此，可能需要对组织和血液样本进行进一步的功能研究。关于ctDNA与组织NGS一致性的解释，ctDNA和组织测序的基因panel和测序管道存在差异，这种差异可能会限制对本研究结果的解释。未来的研究可能需要对两种样本类型采用统一的方法。尽管如此，本研究结果可能有助于提出假设并设计未来的前瞻性试验，包括深入探索个体耐药机制和基于ctDNA结果的治疗分层。

综上所述，我们在89.7%的患者中发现了新获得的突变，通常涉及HRR恢复、复制叉稳定和生存通路上调相关基因。这些非互斥的多种耐药机制对进展后的治疗和生存有影响。连续进行ctDNA检测可能有助于识别患者特异性原发性和获得性耐药机制，可用于指导个体化治疗，最终克服原发性和获得性PARPi耐药，为卵巢癌患者带来临床获益。

参考文献：

Kim, Y. N., Shim, Y., Seo, J., Choi, Z., Lee, Y. J., Shin, S., ... & Lee, S. T. (2023). Investigation of PARP Inhibitor Resistance Based on Serially Collected Circulating Tumor DNA in Patients With BRCA-Mutated Ovarian Cancer. Clinical Cancer Research, OF1-OF10.

来源 | 健康界

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