薄靳华1 王鑫梅2 朱魏1 黄瑜琳1 孙玉娥1 史长喜1

1南京大学医学院附属鼓楼医院麻醉科，南京 210008；2中国药科大学南京鼓楼医院药学部，南京 210009

国际麻醉学与复苏杂志,2023,43(04):346-352.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20220518‑00770

基金项目 

国家自然科学基金（81600958）；

南京市卫生科技发展项目（ZKX18018）；

鼓楼医院新技术发展基金（XJSFZJJ202016）；

南京大学医学院附属鼓楼医院临床试验基金

（2022‑LCYJ‑PY‑37）

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本研究拟观察瑞芬太尼对BV‑2小胶质细胞沉默调节蛋白2（SIRT2）、离子钙接头蛋白1（Iba1）、TNF‑α、IL‑1β水平的影响，明确瑞芬太尼对小胶质细胞活化的具体作用靶点，以期为后期开展相关研究提供参考。

1材料与方法

1.1实验材料

瑞芬太尼、胎牛血清、山羊血清、DMSO、PBS、SIRT2、Iba1、TNF‑α试剂盒、IL‑1β试剂盒、RIPA裂解液、β‑actin抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG抗体、HRP标记山羊抗兔抗体、胰酶、DMEM培养基，蛋白浓度检测试剂盒。

1.2实验仪器

细胞培养箱、高速冷冻离心机、多功能酶标仪、凝胶电泳系统、凝胶成像系统、荧光显微镜。

1.3药物处理

无菌PBS稀释溶解瑞芬太尼，母液浓度为10 mmol/L，分装保存于−80 ℃冰箱中。DMEM/F12培养液梯度稀释母液至工作液浓度为10、50、100 μmol/L，现配现用处理小胶质细胞。

1.4实验分组

剂量依赖性实验：将培养的BV‑2小胶质细胞分为空白对照组（C组）、瑞芬太尼10 μmol/L组（R1组）、瑞芬太尼50 μmol/L组（R2组）、瑞芬太尼100 μmol/L组（R3组），接种于6孔培养板中，每组1孔，每孔细胞105个，待细胞基本贴满板底后，R1组、R2组、R3组将培养液分别更换为单纯DMEM/F12培养液配置的瑞芬太尼2 ml（R1组瑞芬太尼10 μmol/L、R2组瑞芬太尼50 μmol/L、R3组瑞芬太尼100 μmol/L），孵育2 h后测定各组细胞SIRT2、Iba1、IL‑1β、TNF‑α水平。以上步骤重复3次取均值。

时间依赖性实验：另取培养的BV‑2小胶质细胞分为：空白对照2组（C2组）、15 min组（T1组）、1 h组（T2组）、2 h组（T3组），接种于6孔培养板中，每组1孔，每孔细胞105个，待细胞基本贴满板底后，T1组、T2组、T3组将培养液更换为单纯DMEM/F12培养液配置的100 μmol/L瑞芬太尼2 ml（T1组刺激15 min、T2组刺激1 h、T3组刺激2 h），孵育后测定各组细胞SIRT2、Iba1、IL‑1β、TNF‑α水平。以上步骤重复3次取均值。

1.5方 法

1.5.1细胞培养实验

取出液氮中冻存的细胞，于37 ℃恒温水浴锅中迅速复温：细胞转移到离心管中，加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，800 r/min离心5 min（离心半径20 cm），弃上清，在培养液中吹打细胞分散，并将细胞接种于50 cm2培养瓶内，置于敷箱中；后续细胞传代，将培养瓶中的细胞无菌0.01 mol/L PBS 1 ml漂洗后，0.25%胰酶1 ml消化1 min，加入1 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化；仔细吹打瓶底，收集消化细胞，800 r/min离心5 min（离心半径20 cm），弃上清；加入DMEM/F12培养基，小心吹打分散细胞；接种在50 cm2培养瓶内，放置于5%CO2+95%空气中，pH 7.2~7.3，37 ℃培养箱中，培养3~5 d传代1次。

1.5.2免疫荧光实验

BV‑2小胶质细胞株传代两次后，接种在含14 mm圆形盖玻片的无菌12孔板中，种植密度为105个/孔，培养3 d后，将细胞爬片取出，用0.01 mol/L PBS缓冲液漂洗3次，每次5 min。37 ℃环境下用10%的山羊血清封闭30 min，随后吸水纸吸掉细胞爬片上的血清封闭液，滴加抗体稀释液稀释的anti‑Iba1抗体、anti‑SIRT2抗体（1∶100）于37 ℃孵育1 h，而后在4 ℃孵育过夜。次日用0.01 mol/L PBS漂洗爬片3次，每次5 min。爬片取出后用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG荧光二抗（1∶5 000）于37 ℃下避光孵育1.5 h，再次用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min。细胞爬片取出后，滴加4'，6‑二脒基‑2‑苯基吲哚（1∶1 000）室温避光孵育5 min，随后用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min。最后，吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，于荧光显微镜下观察SIRT2、Iba1在BV‑2小细胞株上的表达。

1.5.3Western blot实验

干预结束后，弃去上清液，PBS清洗2遍，每孔加入60 μl RIPA裂解液，使用前加入PMSF至终浓度1 mmol/L，在冰上混匀，20 min进行裂解，用细胞刮子收取细胞，并收集到1.5 ml离心管中准备提取细胞总蛋白质。使用冷冻高速离心机，4 ℃，12 000 g，离心15 min（离心半径20 cm），然后吸取上清，即为细胞总蛋白。BCA法测定SIRT2、Iba1蛋白浓度。按照每4 μl蛋白样品加入1 μl SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液混合，煮沸5 min。上样20 μg至8% SDS‑PAGE电泳，分离后将蛋白质电转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗SIRT2、Iba1、β‑actin抗体，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜，5 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000），孵育2 h。TBST洗膜，5 min×3次。ECL化学发光液作用1 min，压片、显影和定影。以目的蛋白条带灰度值与β‑actin条带灰度值的比值反映目的蛋白水平。

1.5.4ELISA实验

采用ELISA法测定各组细胞IL‑1β、TNF‑α水平，严格按照酶联免疫试剂盒说明书进行操作。使用酶标仪检测光密度，读取D值，然后绘制标准曲线进行相应时间点的浓度测算。

2结果

2.1BV‑2小胶质细胞中SIRT2、Iba1表达定位

免疫荧光结果显示BV‑2小胶质细胞中存在SIRT2表达，主要定位于细胞质中。在与Iba1共染色的荧光结果显示，SIRT2与Iba1存在共表达现象。其中SIRT2与Iba1共表达的细胞占总细胞数的80.1%。见图1。

2.2各组细胞Iba1水平比较

与C组比较，R1组、R2组、R3组Iba1水平增加（P<0.05）；与R1组比较，R2组、R3组Iba1水平增加（P<0.05）。见图2。

与C2组比较，T1组、T2组、T3组Iba1水平增加（P<0.05）；与T1组比较，T2组、T3组Iba1水平增加（P<0.05）。见图3。

2.3各组细胞SIRT2水平比较

与C组比较，R1组、R2组、R3组SIRT2水平降低（P<0.05）；与R1组比较，R3组SIRT2水平降低（P<0.05）；与R2组比较，R3组SIRT2水平降低（P<0.05）。见图4。

与C2组比较，T1组、T2组、T3组SIRT2水平降低（P<0.05）；与T1组比较，T2组、T3组SIRT2水平降低（P<0.05）；与T2组比较，T3组SIRT2水平降低（P<0.05）。见图5。

2.4各组细胞IL‑1β、TNF‑α水平比较

与C组比较，R1组、R2组、R3组IL‑1β水平增加（P<0.05）；与R1组比较，R2组、R3组IL‑1β水平增加（P<0.05）。与C组比较，R1组、R2组、R3组TNF‑α水平增加（P<0.05）；与R1组比较，R3组TNF‑α水平增加（P<0.05）。见图6。

与C2组比较，T1组、T2组、T3组IL‑1β、TNF‑α水平增加（P<0.05）；与T1组比较，T2组、T3组IL‑1β、TNF‑α水平增加（P<0.05）；与T2组比较，T3组IL‑1β、TNF‑α水平增加（P<0.05）。见图7。

3讨论

本研究发现瑞芬太尼可以诱导BV‑2小胶质细胞Iba1表达增加，本研究依次使用10、50、100 μmol/L 3个剂量的瑞芬太尼孵育BV‑2小胶质细胞，发现瑞芬太尼可以导致Iba1水平增加，且瑞芬太尼浓度为50、100 μmol/L时Iba1增加更加明显，瑞芬太尼浓度为100 μmol/L时增加最多。实验继续检测了10、50、100 μmol/L 3个剂量的瑞芬太尼对BV‑2小胶质细胞IL‑1β、TNF‑α水平的影响，发现瑞芬太尼可以导致IL‑1β、TNF‑α水平增加，而瑞芬太尼浓度为50、100 μmol/L时增加更多，瑞芬太尼浓度为100 μmol/L时增加最多。研究证明不同剂量的瑞芬太尼均可以导致BV‑2小胶质细胞激活，IL‑1β、TNF‑α水平增加，趋势呈剂量依赖性。另外，研究使用100 μmol/L瑞芬太尼进行时间依赖性实验，结果发现，瑞芬太尼孵育15 min、1 h、2 h后Iba1、IL‑1β、TNF‑α水平增加，且增加呈时间依赖性。本研究证明，瑞芬太尼导致BV‑2小胶质细胞的活化呈剂量依赖性和时间依赖性，这与瑞芬太尼在体实验的结果一致，说明瑞芬太尼可以导致Iba1水平增加，小胶质细胞被激活。

此外，SIRT2在小胶质细胞活化中发挥的重要作用也受到广泛关注。研究发现，SIRT2过表达可显著抑制各种神经性疼痛，而小胶质细胞的激活可能与SIRT2表达受抑制有关。本研究发现，瑞芬太尼可以通过剂量依赖性和时间依赖性的方式抑制SIRT2表达，并使小胶质细胞释放IL‑1β、TNF‑α水平增加，这表明瑞芬太尼激活小胶质细胞导致术后痛觉过敏的过程离不开IL‑1β、TNF‑α、Iba1、SIRT2的共同作用。

国际麻醉学与复苏杂志

International Journal of Anesthesiology and Resuscitation

主管：中华人民共和国国家卫生健康委员会

主办：中华医学会 徐州医科大学

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