撰文丨nagashi

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

如果把细胞比作是精密的机械钟表，那么蛋白质就是其内部大大小小的齿轮，它们是生命活动的主要执行者，发挥着生命基石般的关键作用。而蛋白质结构是其功能的基础，如果我们能任意改造蛋白质结构，那么就能自由控制其功能，其潜在应用无疑非常巨大。

要想实现这一点，准确预测或解析蛋白质的三维空间构象是关键第一步。在过去，想要确定蛋白质结构不仅困难而且耗时耗力。而随着人工智能 （AI） 技术的发展，DeepMind公司开发的AlphaFold，能够仅依据蛋白质序列信息，就能快速准确预测蛋白质三维结构，其强大的能力受到越来越多的关注和应用。

2023年3月29日，CRISPR基因编辑先驱 张锋 教授及其团队在 Natrue 期刊发表了题为： Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system 的研究论文。

在这项最新研究中，张锋团队通过AlphaFold辅助蛋白质设计开发了一种蛋白质递送系统—— 改造、利用独特的细菌“注射器”将蛋白质注射到人类细胞中。 这种新型蛋白质递送方式或将改变基因治疗、癌症治疗等前沿疗法格局，具有强大的应用前景。

内共生细菌是一类特殊的细菌，它们可以寄生在宿主细胞的内部，并已然进化出复杂的传递系统使其分泌调节宿主细胞的生物因子。例如，细胞外可收缩注射系统 （eCIS） ，正是这样一种类似于“注射器”的大分子复合物。eCIS通过驱动一个“针头”结构穿透细胞膜，然后将携带的蛋白质有效载荷注入到真核细胞中。

eCIS广泛分布在细菌和古菌中，并已被证明具有多种天然功能，包括调节宿主细胞骨架、DNA切割，诱导变形运动和产生宿主毒性。最近，有研究发现eCIS可以靶向小鼠细胞，这就提高了eCIS作为蛋白质递送工具的可能性。

然而，eCIS的活性尚未在人类细胞中得到证实，如果想要将eCIS开发为靶向递送系统，就要先阐明 eCIS识别靶细胞的机制。

在这项最新研究中，张锋团队首先选定了eCIS的一个亚型——Photorhabdus virulence cassette （PVC） 。PVC由一个约20kb的操纵子组成，包含16个核心基因 （pvc1-16） ，以及下游的有效载荷Pdp1和Pnf。研究团队发现，PVC有效载荷蛋白的N端高度无序区域是其“包装结构域”，只要将其与想要递送的蛋白 （例如GFP） 融合，就能将其加载到PVC复合体中。

PVC系统可以被重新编程以在真核细胞中定制蛋白递送

值得注意的是，除了N端高度无序区域之外，Pvc13 （尾纤维蛋白） 和Pvc15 （一种ATP酶） 也是该递送系统成功的关键。其中，Pvc13可能参与了PVC复合体的靶标识别，并可用于操纵PVC复合体的靶标特异性。

基于此，研究团队使用AlphaFold预测Pvc13的三维结构，当将其作为三聚体时，Pvc13的C端形成了一个预测的螺旋管结构和一个球状的尖端结合结构域。研究团队由此假设，改变Pvc13的这个尖端结合域的结构特征可能会导致PVC的靶向性发生可预测的变化。

AlphaFold预测和改造Pvc13，以改变PVC系统的宿主细胞靶向性

为了验证这一点，研究团队将针对人类细胞的结合结构域 （Ad5-knob和E01-DARPin） 插入到Pvc13的C端结合域，并测试由此产生的PVC复合体是否可以靶向人类细胞。结果显示，改造后的PVC可以有效杀死A549细胞 （携带毒性基因） 或高效表达GFP （融合蛋白） 。

这些结果表明，Pvc13是PVC复合体的一个靶向性决定元件，该蛋白可以被修饰，从而靶向特定的细胞系。

PVC介导的蛋白递送具有高度特异性

进一步研究显示，改造后的PVC复合体还可以自由装载spCas9、锌指脱氨酶 （ZFD） 以及细胞毒素等不同的效应元件，前两者分别实现对靶细胞DNA的基因编辑和不依赖RNA的基因编辑，后者则可以靶向清除癌细胞、衰老细胞等有害细胞。

改造后的PVC系统可以靶向递送多种效应元件

不仅如此，为了验证PVC递送系统在活体动物中的效果，张锋团队再次使用AlphaFold引导Pvc13的工程化设计，并筛选到两种靶向小鼠细胞的PVC系统——Pcc-13-Ad5-knob（RGD/PK7）和Pvc13-Anti-MHCII Nb。与预期一致，前者表现出较为广泛的趋向性 （正如Ad5 RGD/PK7病毒感染那样） ，而后者则对MHC+免疫细胞表现出强烈的偏好性。

张锋 团队还发现，PVC治疗没有产生任何显著的免疫细胞激活、炎症细胞因子产生、体重损失或细胞毒性，这表明PVC治疗在实验过程中没有产生免疫原性或毒性。此外，PVC治疗七天后就无法从小鼠大脑中检测到PVC相关蛋白，这表明PVC递送系统仅在大脑中短暂停留，不会持续太长时间。

重编程的PVC系统在小鼠体内实现靶向递送

总的来说，这些结果表明， PVC系统经过改造后可以在细胞和体内靶向递送蛋白质，并在基因编辑、癌症治疗和临床靶向递送等领域展现出广阔的应用前景，未来可能成为许多生物疗法的关键递送工具。

来源 | 健康界

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