随着高通量测序技术、三代测序技术以及生物信息学分析的进步，越来越多的环状RNA被发现和研究。环状RNA由于其共价闭合环状的结构，缺少核酸外切酶介导降解所必需的末端，因此与线性RNA相比，环状RNA的半衰期更长，稳定性高，且不易被核酸外切酶降解。在某些应用方面，环状RNA比线性RNA更有优势。

环状RNA可作为疾病生物标志物或新型RNA治疗靶点，在基因工程和开发疫苗方面也具有很大潜在应用价值。根据内源circRNA环化的原理，研究侧翼内含子序列、蛋白等对环化的促进或抑制作用，构建过表达载体，可以为环状RNA在体内的功能研究提供一个强有力的工具。本文将介绍常见的过表达环状RNA方法。

01、经典侧翼序列介导成环的过表达载体

这类过表达载体包RNA序列和反向互补的侧翼序列来促进环化剪接，转染到细胞中可以主动促进成环。互补序列可以发生在重复元件中，例如Alu元件，可以通过挑选上游内含子的一个区域，并将其反向插入环状RNA的下游来创建互补序列。 

对于不同的环状RNA，可以将其自身的上游和下游侧翼序列（通常取200-1000nt）与circRNA序列分段克隆，构建在真核表达载体上。为了构建更通用的过表达载体，侧翼序列通用框架被构建并不断被优化。

Dieterich等构建的环状RNA过表达通用载体主要由三部分组成：可反向互补配对的上下游内含子（~800 bp），以及RNA环化序列，其两侧保留可供剪接识别的特异性内源侧翼基因组序列（每个约200 bp）和多嘧啶序列（PPT）。上游内含子片段和下游内含子片段在转录后通过反向互补配对形成稳定的RNA发夹结构促进环状RNA的环化。通过将目的circRNA的环化序列插入到MCS中互补的内部序列之间，该载体可以用于表达几乎任何环状RNA。

该过表达载体实现了比传统克隆更高的环状RNA表达，比内源性水平高400-5000倍，转化效率超过55%，副产物很少。此外，各种商品化通用过表达载体相继推出。

这种方法构建方法简便，是目前最常用过表达环状RNA的方法。但通常导致环状RNA剪接位点的随机插入。此外，该过表达载体转染入细胞中会导致线性转录本和环状RNA共同产生，理论上应该对产生的线性和环状转录本的数量进行实验评估，并谨慎解释实验数据及实验现象。

02、基于核酶构建的环状RNA过表达载体

核酶 （ribozyme） 是指具有催化功能的小分子RNA，可以降解特异的RNA序列。自剪切核酶一般可以产生5’端的游离羟基和3’端的2’,3’-环磷酸酯结构，RtcB可以将其连接。

Jaffrey等在2015年就曾经报道设计了基于tRNA的环状RNA过表达体系 （tricY） ，tRNA加工成熟的过程中内含子区域可以借助RtcB实现自连环化。Jaffrey等随后在2019年提出一种更高效的核酶过表达载体 （Tornado） ，该技术是基于具有自剪切功能的核酶Twister核酸酶，实现待环化序列的上下游切割，依赖内源的RNA连接酶RtcB连接，但最终的产物包含了待环化序列以及为实现环化而携带的连接序列。

这种方法的一个限制是不可避免地在RNA环化连接位置将外显子短片段（E1和E2）引入新生成的环状RNA中，这将限制在基因疗法中合成对外来序列敏感的CircRNA和RNA纳米颗粒，以及合成准确的内源性环状RNA序列。

总之，基于核酶构建的过表达载体的表达一般较为高效，稳定。研究发现，通过将核糖体进入位点构建至基于核酶构建的环状RNA过表达载体中，可以促使环状RNA高效稳定地翻译蛋白，这也开创了外源性环状RNA在真核生物中表达蛋白的先例，为环状RNA的新应用奠定了理论基础。

03、基于二聚体RNA结合蛋白过表达环状RNA

该过表达环状RNA转录本的方法是将特定RBPs的结合域包含在侧翼内含子中以促进RNA的环化，其他过表达环状RNA方法是把成环序列构建到质粒中，将外源的序列导入细胞中。

这种方法避免了过表达环状RNA时线性转录本的引入，但是会额外引入RNA结合蛋白在细胞中的表达。  

来源 | 健康界

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