在癌症基因突变检测中，最常见的样本就是甲醛固定石蜡包埋（Formaldehyde Fixed Paraffin Embedded FFPE）组织样本。

组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有结构，因此，在临床上，手术切下的组织需要进行固定，然后以石蜡替换组织中的水分，再根据需求对其进行切片，染色以后，就可以观测组织中的细胞形态，结构，进行病理学的判断。

然而，对于笔者这种基因检测从业者来说，看着组织样本被这样处（zao）理（ta），小心脏是一抽一抽的疼啊。

笔者上学时研究的课题是动物的功能基因，那个时候为了保证样本新鲜，可谓无所不用其极，去野外采样恨不得也抗个液氮罐…….，用甲醛处理样本…..想都不敢想的事儿，再用石蜡包埋…..估计导师能把我埋了…..

因为对于基因检测来说，核酸质量越好，检测结果越准确，而要得到质量好的核酸，样本的“新鲜”程度，是一个很大的影响因素。但是甲醛固定石蜡包埋却会对样本核酸产生很大的破坏。甲醛对样本的处理会破坏DNA的结构，造成DNA的片段化，而且还会使DNA序列中的胞嘧啶C水解脱氨转化为尿嘧啶U（等于引入了突变），同时造成蛋白质与DNA分子产生交联，蛋白质与DNA交联以后，就比较难以用常用的核酸提取试剂（去污剂，有机溶剂等）使其分离，而石蜡的包埋会使提取使用的消化液不能与样本接触，组织不能消化完全，核酸不能释放，造成提取失败。

然而，因为病理学的需要，和现实情况（总不能让大夫扛着液氮罐进手术室….），FFPE样本还是医院能提供的最常见样本，怎么样从FFPE样本中提取可用的核酸，是决定后续基因检测能否进行和检测结果是否准确的基本条件。

目前市场上有很多种从FFPE提取核酸的试剂盒，笔者陆陆续续也用过不少，一般来说，石蜡样本的提取分为脱蜡，消化，核酸修复，结合绑定，清洗，洗脱等几个步骤。但是即使使用的是同一种试剂盒，提取的效果也可能大相径庭，笔者认为，有些操作细节决定了提取的成败。

1、脱蜡：“脱蜡不彻底=彻底不脱蜡”A

脱蜡是石蜡样本核酸提取的第一步，脱蜡的试剂，早期普遍使用二甲苯，但因为二甲苯毒性以及会损害DNA等问题，目前出现了一些替代试剂如矿物油等，使用什么试剂进行脱蜡不重要，重要的是要保证脱蜡完全，然而很多时候，如果只机械地按照试剂盒说明书进行脱蜡，很容易造成脱蜡不彻底。因为在实际操作中，加入样本的量，石蜡的质地，都会影响脱蜡效果。

笔者的经验，样本在脱蜡试剂中孵育的过程可以适当延长，而且强烈建议进行两次脱蜡操作，即首次用脱蜡试剂浸泡孵育以后，去除第一次使用的脱蜡试剂，再次加入脱蜡试剂，重复进行孵育，如果提供的脱蜡试剂较少，则可以减少试剂量，进行两次脱蜡操作，还有如果石蜡样本切片较厚或较大，可用移液器吹打破碎，增加样本的表面积，利于彻底脱蜡。脱蜡彻底的样本，在干燥以后会呈现出类似“干燥纸片”质地，可目测确定脱蜡的情况，如存疑，则不要嫌麻烦，再来一次。

2、蛋白酶消化：“消化不彻底≈彻底不消化”

蛋白酶消化是样本提取过程中最耗时的过程，很多试剂盒提出的消化时间是“1小时”，但也经常会在后面偷偷加一句“或至消化完全”。实际操作中，笔者发现，如果没有完全消化，则经常会出现核酸得率低，纯度低等种种问题。很多时候，要消化彻底，1个小时是不够的，这时千万不可着急进行下一步，一定要确认消化完全（溶液澄清，不粘稠）。为何会出现消化不完全的情况，如果加热仪器没有故障，且脱蜡完全，振荡速度合适，那基本上是因为加样量太多，俗话说“贪多嚼不烂”脱蜡时，我们经常会害怕得到的组织量不够，当看到组织量很多时往往会松一口气

然而......

当你确认脱蜡完全，而管底有一大坨组织时，千万记着，别急着往里加蛋白酶，取一部分提取就够了，另外尽量把组织捣碎一些。如果消化很久，但组织还是残余，不要凑合往下做，加点蛋白酶和你的耐心，一定要消化完全。

还有一种情况经常发生，当你消化很久以后溶液已经澄清，不粘稠，而你回忆开始提取的组织量也不是很多，但是总有一些固体在管底顽固的坚持……这个时候，很可能就是一些非蛋白的杂质，也许是肺组织里面的积累的灰尘或者是肠组织里面残余的…….，给自己点信心继续往下做吧。

3、DNA修复

很多试剂盒有一个90℃孵育1小时的步骤，这是在进行去除蛋白交联和DNA修复工作。这个步骤有个细节要注意，90℃孵育结束时不要急着把管子拿出来，因为这个时候，管内温度高，气压大，轻微的碰撞，可能造成管盖爆开，容易造成环境污染和样本污染，所以关闭加热仪器后，耐心等温度降低，不要急着拿除了爆管……还很烫手。

好了，当你完成上述工作，基本上就能拿到质量较好的核酸了，后续就是绑定，清洗，洗脱等常规工作……按照说明书操作即可，当然，一定要确认好——洗液已经加了酒精。

来源 | 健康界

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